В чем разница между ПЦР, кПЦР, ОТ-ПЦР и ОТ-кПЦР

Все четыре метода — ПЦР, кПЦР, ОТ-ПЦР и ОТ-кПЦР — базируются на принципах полимеразной цепной реакции, но отличаются своими задачами и сферами применения. Каждый из них служит уникальным инструментом для обнаружения и анализа.:

• ПЦР применяется для амплификации и выявления специфических последовательностей ДНК.
• кPCR позволяет количественно определять концентрацию ДНК или кДНК в режиме реального времени.
• ОТ-ПЦР используется для амплификации и обнаружения молекул РНК.
• ОТ-ПЦР в режиме реального времени сочетает подходы ОТ-ПЦР и qPCR для количественного анализа РНК.

1. Классическая ПЦР, или ПЦР первого поколения, использует двухцепочечную ДНК в качестве матрицы и dNTP в качестве строительных блоков для специфической амплификации двухцепочечной ДНК. Полученные продукты затем анализируются качественно с помощью электрофореза в агарозном геле. Процесс ПЦР включает три ключевых этапа: денатурацию при высокой температуре (примерно 95 ℃), отжиг при более низкой температуре (от 55 до 60 ℃) и элонгацию при умеренной температуре (около 72 ℃, что соответствует оптимальной активности ДНК-полимеразы). После многократного повторения циклов денатурации, отжига и элонгации целевая ДНК может быть амплифицирована в миллионы раз. Для визуализации и анализа амплифицированной ДНК применяется электрофорез в геле, который позволяет разделить фрагменты ДНК по размеру для их идентификации и очистки. Для данного метода используются классические термоциклеры (амплификаторы).

2. Количественная ПЦР в реальном времени (qPCR), относящаяся к ПЦР второго поколения, регистрирует флуоресцентные сигналы, испускаемые целевыми генами, помеченными флуоресцентными зондами, на этапе удлинения в процессе амплификации. Количество копий или уровень экспрессии целевого гена определяется на основе взаимосвязи между тремя параметрами: интенсивностью флуоресцентного сигнала, значением порогового цикла (Ct) и начальной концентрацией целевого гена. Однако, поскольку абсолютное количественное измерение зависит от значений Ct и стандартных кривых, такая «квантификация» является в некоторой степени относительной. Кроме того, чувствительность, точность и разрешение метода ограничены при работе с образцами, имеющими незначительные различия в концентрации или низкое количество копий целевого гена. В qPCR широко применяются два метода флуоресцентной детекции: зонды TaqMan и краситель SYBR Green. Для данного метода используются амплификаторы "в реальном времени".

3. Обратная транскрипция ПЦР (ОТ-ПЦР) предполагает преобразование цепи РНК в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью фермента обратной транскриптазы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы). Полученная кДНК служит матрицей для последующей амплификации ДНК с использованием стандартной ПЦР, где задействуются дезоксинуклеотидные праймеры и ДНК-зависимая ДНК-полимераза. В каждом цикле количество кДНК удваивается, следуя стандартным этапам ПЦР. В качестве исходного шаблона может использоваться общая РНК, мРНК или синтезированные in vitro РНК-продукты. Для данного метода используются классические термоциклеры (амплификаторы).

4. Метод ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-qPCR) сочетает в себе подходы ОТ-ПЦР и количественной ПЦР (qPCR) для точного измерения количества молекул РНК. Этот метод активно применяется в исследованиях экспрессии РНК, включая анализ активности генов и оценку вирусной нагрузки. Для данного метода используются амплификаторы "в реальном времени".